神經(jīng)性貝類毒素HPR酶標(biāo)抗原

神經(jīng)性貝類毒素(neurotoxic shellfish poisoning，NSP)主要是指從一種赤潮生物短裸甲藻(Ptychodiscusbreve)中分離出的一類毒素——短裸甲藻毒素(brevetoxins，PbTx)的理化特性和藥理特性與西加毒素(CTX)相似。PbTx可引起魚類、軟體動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、海綿動(dòng)物、棘皮動(dòng)物及底棲藻類的大量死亡。有毒的短裸甲藻被貝類攝食后，其毒素在體內(nèi)積累，并通過(guò)食物鏈傳遞給人類，引起食物中毒。中毒的主要癥狀為瞳孑L放大，身體冷熱無(wú)常，惡心、嘔吐、腹瀉，運(yùn)動(dòng)失常，但沒(méi)有麻痹感。因此，為了與引起麻痹作用的DSP相區(qū)別，稱為神經(jīng)性貝類毒素。NSP中毒癥狀持續(xù)時(shí)間較短，一般從10min～20h。

免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應(yīng)而建立起來(lái)的一種生物化學(xué)分析法，即根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)，采用特異性抗體來(lái)檢測(cè)藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等物質(zhì)的定量分析方法。免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、放射性免疫法、熒光免疫法等，具有方便、快速的特點(diǎn)，但也存在一定的缺點(diǎn)，如費(fèi)用較高、毒素之間的交叉反應(yīng)難避免、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較差等。

ELISA是檢測(cè)海洋生物毒素所采用的主要免疫方法。該技術(shù)可用目測(cè)，也可用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值，具有易定性定量的優(yōu)點(diǎn)^[6]。Tsao等^[7]采用單克隆抗體ELISA檢測(cè)法檢測(cè)ASP中的軟骨藻酸(domoic acid, DA)，并建立了基于單克隆抗體的膠體金免疫條檢測(cè)法；該方法的檢測(cè)限為5 ng/mL，在10 min內(nèi)就可完成測(cè)定，提示免疫條檢測(cè)可用來(lái)快速檢測(cè)貝類樣品中的DA。也有研究者建立了基于基因工程單鏈抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，該方法最大的優(yōu)勢(shì)是毒素可在大腸桿菌中快速、大量得到表達(dá)，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用于檢測(cè)或其他用途；對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其與標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)結(jié)果有較好的相關(guān)性^[8]。李軍濤等^[9]建立DSP免疫熒光層析試紙條檢測(cè)方法，靈敏度可達(dá)0.125 μg/mL，達(dá)到我國(guó)貝類產(chǎn)品中DSP所允許的*。Dubois等^[10]建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)STX，該方法用毒素的偶聯(lián)物免疫產(chǎn)生的抗體來(lái)檢測(cè)貽貝、牡蠣和扇貝中的STX類毒素；在檢測(cè)之前，用90%的乙醇溶液將STX類毒素從貝類組織里快速提取出來(lái)，該方法的*檢測(cè)限為5 μg/kg。Garthwaite等^[11]也建立了4類貝毒的ELISA方法，均可滿足貝類提取物中樣品的鑒定，且樣品回收率較高。TTX為氨基全氫喹唑啉型化合物，是自然界中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一^[12]。Thattiyaphong等^[13]建立了一種側(cè)流免疫層析技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)TTX的快速檢測(cè)，并運(yùn)用該方法檢測(cè)了河鲀及食用魚中TTX的含量；與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)相比，該方法的靈敏度為94.0%，特異性為92.4%。總的來(lái)說(shuō)，側(cè)流免疫層析技術(shù)可用于大批量樣本的篩選，陽(yáng)性結(jié)果的樣本再使用LC-MS/MS進(jìn)行確認(rèn)，減少了LC-MS/MS的測(cè)試量，降低了檢測(cè)成本。Reverte等^[14]開發(fā)了一種基于雙硫醇自組裝單分子膜的新ELISA方法，該方法可用于檢測(cè)河鲀中TTX的含量，檢測(cè)限為0.23 mg/kg，其與LC-MS/MS法的相關(guān)性為0.991。

大田軟海綿酸(okadaic acid, OA)是DSP中的主要成分，屬于聚醚類海洋生物毒素，尚無(wú)致死病例，但長(zhǎng)期攝入可以致畸及致癌^[15]。劉仁沿等^[16]通過(guò)細(xì)胞融合，制備抗OA單克隆抗體和膠體金標(biāo)記抗體，建立快速檢測(cè)OA的免疫層析試紙條分析方法，該方法檢出限為500 ng/mL。該研究組在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，使用卵清蛋白合成高耦聯(lián)比的包被抗原，以硝酸纖維素膜為載體，改進(jìn)后方法檢測(cè)限達(dá)12 ng/mL^[17]。張洋等^[18]采用自行研發(fā)的免疫膠體金試紙條對(duì)雙貝殼類DSP的主要成分OA的污染情況進(jìn)行調(diào)查，通過(guò)與ELISA檢測(cè)法的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，未出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。Johnson等^[19]對(duì)4種已經(jīng)商業(yè)化的快速檢測(cè)試劑盒是否可檢測(cè)英國(guó)雙殼貝類中的DSP進(jìn)行驗(yàn)證。這4種試劑盒包括1種ELISA試劑盒、1種蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)試劑盒以及2種側(cè)流免疫測(cè)定(lateral flow immunoassay, LFI)試劑盒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ELISA與LC-MS/MS具有較好的相關(guān)性，且不存在結(jié)果偏大的情況，但是存在假陰性結(jié)果；2種LFI試劑盒與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果大部分具有一致性，但存在假陰性結(jié)果。總的來(lái)說(shuō)，選擇何種方法去檢測(cè)DSP主要取決于檢測(cè)要求、實(shí)驗(yàn)室的條件、實(shí)驗(yàn)人員是否經(jīng)過(guò)訓(xùn)練以及對(duì)結(jié)果的要求是半定量的還是定性的。